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避免踩坑，注意別踩DNA測序里的大坑！
發布時間： 2021-08-27 點擊次數： 8199次DNA 測序技術自從發明以來，作為一種重要的分子生物學手段，正在科研和臨床上得到了越來越廣泛的應用。下面，介紹一下DNA測序里的大坑。給大家一個前車之鑒吧。
坑一：信號衰減/中斷
測序信號衰減和中斷，是測序過程中的常見問題，原因多種多樣：模板中含有重復序列，模板中含有高級結構，模板中 GC 含量過高等，都會使得測序信號衰減和中斷。另外，引物的質量不好，試劑失活了，都會造成這種問題。解決的方法：反其道而行之，采用反向引物來進行測序，然后通過序列拼接獲得全長。有時候就象做拼圖游戲。大家 have fun 吧。這里，教大家一個小竅門：在這個過程中，可以適量地加入 DMSO，并且進行擴增。
坑二：重疊峰/亂峰
這個問題一般是由于序列前面有連續的堿基，或者是引物的堿基缺失了。如下圖所示，模板中有單一位點的堿基缺失，堿基缺失導致測序結果移碼。
現在有很多測序公司，號稱可以幫助設計引物；號稱引物是 PAGE 級別的。這里，嚴重不推薦哈。最好還是自己動手，豐衣足食。解決辦法：自己設計引物；自己合成引物；自己將引物進行 PAGE 純化。反正就是掌握一個原則：自己動手，豐衣足食。
坑三：Ploy 結構
有的時候，我們會遇到 Poly 結構，就是 G/C rich，G/C Cluster，Poly A，Poly T 結構等。這種結構的測序容易出現移碼現象，導致測序信號衰減和中斷（如下圖）。解決方法：還是反其道而行之。采用反向引物對模板進行測序，測到該 poly 結構處，進行拼接，不就可以獲得序列全長嘛。
坑四：空載體
原因為：目的片段插入失敗，或者培養過程中目的片段丟失。解決方案：重起爐灶。重新挑選單克隆，進行 PCR 后，再送去測序。
坑五：測序結果和文獻資料不一樣
這個會以為是實驗哪里出問題了，或者是測序公司那里出問題了。這個問題是沒有辦法滴。同一種動物，不同的種族，甚至不同的個體，基因序列都不一定*一樣。如果是 PCR 產物克隆測序，那還有 PCR 過程中的錯配因素等等。
一般比較正規的測序公司，提供的測序結果都是忠實結果，和文獻序列不一樣，也就只好不一樣啦。
坑六：重復序列
如下圖所示，好看吧？好看是好看，但是真的看到這個結果，可能就要哭鼻子了。可能的原因：樣品中就含有重復序列，結果導致：測序結果和 Poly A/T 的結果一樣。這也會導致 Frame 滑動，結果出現移碼。
解決辦法: 還是反其道而行之，反向測序。有時能夠順利的通過重復序列區域，但是有時候又不一定能夠。全靠運氣吧。如果能夠的話，通過多次的測序結果比對，還是做拼圖游戲吧，拼接可以得到全序列結果。
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