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DNA 甲基化測序常用方法

發(fā)布時間： 2021-08-26　　點擊次數(shù)： 1906次

隨著高通量測序技術(shù)（NGS）技術(shù)的發(fā)展，使我們能夠從全基因組水平來分析 5’甲基胞嘧啶及組蛋白修飾等事件，由此能夠發(fā)現(xiàn)很多傳統(tǒng)的基因組學(xué)研究所不能發(fā)現(xiàn)的東西，這就是所謂的“DNA 甲基化測序"！

DNA 甲基化測序方法按原理可以分成三大類：
1、重亞硫酸鹽測序；
2、基于限制性內(nèi)切酶的測序；
3、靶向富集甲基化位點測序；

基于以上原理又有數(shù)種不同的測序方法，下面，就介紹 10 種 DNA 甲基化測序的常用方法：

1) 重亞硫酸鹽測序
該方法可以從單個堿基水平分析基因組中甲基化的胞嘧啶。首先，利用重?zé)熈蛩猁}對基因組 DNA 進(jìn)行處理，將未發(fā)生甲基化的胞嘧啶脫氨基變成尿嘧啶。而發(fā)生了甲基化的胞嘧啶未發(fā)生脫氨基，因而，可以基于此將經(jīng)重亞硫酸鹽處理的和未處理的測序樣本進(jìn)行比較來發(fā)現(xiàn)甲基化的位點。

2）重亞硫酸鹽處理后接頭標(biāo)記技術(shù)(PBAT)
為了避免重亞硫酸鹽處理時模板的丟失，通常會在重亞硫酸鹽處理后進(jìn)行接頭連接和隨機(jī)引物的擴(kuò)增。

3）限制性內(nèi)切酶-重亞硫酸鹽靶向測序(RRBS)
該技術(shù)是指對基因組上 CpG 島或 CpG 甲基化較密集的區(qū)域進(jìn)行靶向測序。樣本首先經(jīng)幾種限制酶進(jìn)行消化處理，然后經(jīng)重亞硫酸鹽處理，最后再測序。這種方法可以發(fā)現(xiàn)單個核苷酸水平的甲基化。

4）氧化-重亞硫酸鹽測序(oxBS-Seq)
5’羥甲基胞嘧啶(5’hmC)是 5’甲基胞嘧啶脫甲基成胞嘧啶過程的中間產(chǎn)物，重亞硫酸鹽測序無法對二者進(jìn)行區(qū)分。通過氧化-重亞硫酸鹽測序，5’甲基胞嘧啶保留，而 5’羥甲基胞嘧啶(5’hmC)被氧化，進(jìn)而脫氨基成尿嘧啶。通過將經(jīng)過氧化處理和未處理的樣本進(jìn)行測序比較，即可從單個堿基水平分辨 5’羥甲基胞嘧啶(5’hmC)和 5’甲基胞嘧啶。

5）TET 輔助的重亞硫酸鹽測序(TAB-seq)
TAB-seq 采用葡萄糖亞胺與 5’羥甲基胞嘧啶(5’hmC)作用來保護(hù)免受 TET 蛋白的氧化。5’甲基胞嘧啶和未甲基化的胞嘧啶被脫氨基成尿嘧啶，進(jìn)而可以從單個堿基水平鑒定 5’羥甲基胞嘧啶(5’hmC)。

6）甲基化敏感性的限制酶測序(MRE-Seq)
MRE-Seq 將甲基化作用的敏感性和限制酶的特異性結(jié)合起來進(jìn)而鑒定 CpG 島的甲基化狀態(tài)。

7）HELP-Seq
HELP-Seq 采用 HpaII 及其甲基化不敏感的限制性內(nèi)切酶 MSPI 處理，來對基因組內(nèi)及基因組間的甲基化位點進(jìn)行比較，進(jìn)而實現(xiàn)甲基化測序。

8）甲基化 DNA 免疫共沉淀測序(MeDIP)
MeDIP 是一種采用抗體或甲基化 DNA 結(jié)合蛋白來捕獲富集甲基化 DNA 的技術(shù)，這種技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)基因組中高度甲基化的區(qū)域，如 CpG 島，但不能進(jìn)行單個堿基水平的分析。

9)甲基化結(jié)合域捕獲技術(shù)(MBD-CAP)
MBD-CAP 技術(shù)利用甲基化 DNA 能夠結(jié)合蛋白 MeCP2,MBD1-2 和 MBD3LI 來對甲基化的 DNA 進(jìn)行免疫沉淀。與 MeDIP 技術(shù)相似，該技術(shù)也是可以發(fā)現(xiàn)基因組中高度甲基化的區(qū)域，不能從單個堿基水平分析甲基化。

10）基于探針的靶向富集技術(shù)
甲基化測序靶向富集技術(shù)采用合成寡核苷酸探針來捕獲 CpG 島、基因啟動子區(qū)域以及其他一些顯著性甲基化的區(qū)域。目前，市面上已有這種商品化的試劑盒。

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