原代細胞都無法擴增幾輪增殖，這被稱為Hayflick極限，因為每一輪的增殖都會縮短端粒。當端粒達到臨界縮短長度時，DNA損傷被觸發(fā)，導致細胞衰老，如果你試圖培養(yǎng)一個珍-稀原代細胞群，當心它最終會死亡，可以對細胞進行操縱，以繞過衰老過程并變得不朽，原代細胞永生化就是有這么神奇的事情。

自發(fā)性永生化細胞最-好-的例子就是癌細胞，它們可能經(jīng)歷了抵抗衰老的基因變化，并且開始“長生不老"。其實許多癌細胞株也沒有這種變化，事實上，喬治·蓋伊（George Gey）這位科學家創(chuàng)造了第一個永生的、可以說是最著名的細胞株：HeLa細胞，他在偶然發(fā)現(xiàn)亨麗埃塔（Henrietta）手術(shù)后的腫瘤內(nèi)有高度化生長子宮癌細胞，在此之前，他測試了數(shù)百個癌細胞以獲得永生的方法，但是都失敗了。

許多病毒基因影響細胞周期，因此可以通過消除增殖控制的生物剎車來克服衰老。其中許多是腫瘤抑制基因，因為它們需要抑制腫瘤的發(fā)生。其中最常見的是猿病毒大T抗原（SV-40）的過度表達，它抑制細胞的Rb基因和p53基因，這兩種基因都是細胞生長周期的關(guān)鍵控制器。SV40永生化的細胞系著名的例子是HEK293T，也稱為293T細胞，這是一種廣泛用于表達病毒顆粒和細胞分析的細胞系，因為它們很容易轉(zhuǎn)染。其他病毒基因包括來自人乳頭瘤病毒（HPV）的基因，如E6和E7，它們也以Rb和p53基因為靶點，比如人支氣管上皮細胞HBE-E6E7等。

最著名的不朽基因是端粒酶（hTERT）。端粒酶是一種核糖核蛋白，能夠延長端粒的DNA序列，從而減緩衰老過程，使細胞經(jīng)歷無限的細胞分裂。事實上，端粒酶最近被認為是一種逆轉(zhuǎn)衰老的潛在機制。使用端粒酶逆轉(zhuǎn)衰老的問題在于，端粒酶表達增加也會誘導腫瘤生長。事實上，許多用于創(chuàng)造永生化細胞系的基因，如hTERT和SV40，都會誘導腫瘤形成。因此，毫不奇怪的是，hTERT經(jīng)常在人類腫瘤中過度表達，從而賦予癌癥的一個關(guān)鍵特征：不受限制的增殖。這正是我們在使原代細胞系永生化時使用它的目的！

在某些類型的細胞中，僅使用一種永生化方法可能會產(chǎn)生少量永生細胞。因此，根據(jù)您的細胞系，將腫瘤抑制因子（如上述細胞周期抑制劑）的抑制和hTERT的表達結(jié)合起來以增加更多的細胞永生化的可能。如果你想使你的細胞系永生化和轉(zhuǎn)化（即使其像致瘤細胞一樣），也建議使用這種雙重方法，因為有證據(jù)表明，如果沒有永生化，一些細胞系就不能進行有效的轉(zhuǎn)化。

如何將永生引入原代細胞系

以上許多不朽的來源都是基于對原代細胞的基因操作。這需要將外源DNA導入細胞。由于許多原代細胞難以轉(zhuǎn)染，因此將基因改變引入原代細胞的最-簡-單和最-有效的方法是通過病毒感染。

最-流-行的方法是通過復制缺陷慢病毒，因為它們比腺病毒安全，腺病毒具有重新感染細胞的能力，因此含有活病毒的時間更長。逆轉(zhuǎn)錄病毒也可用于轉(zhuǎn)染細胞，然而，它們只能感染活躍分裂的細胞，從而減少可能被病毒轉(zhuǎn)導的細胞數(shù)量。

警告：原代細胞不朽可能不是最-好-的途徑！

通過將基因改變引入細胞，你可能正在深刻地改變細胞系的表型。雖然這確實使你的細胞系在某些方面更有用：它可能使你的細胞更同質(zhì)，從而可以輕松復制結(jié)果，你可以創(chuàng)建大量細胞供將來使用，并且它們可能更容易實驗，但使用原代細胞系仍然有許多好處，原代細胞可以保持正常細胞的新陳代謝，可以維持正常細胞的生理特征，并且具有實驗的統(tǒng)一性和重復性，但隨著原代細胞的永生轉(zhuǎn)染，細胞群體和細胞機制發(fā)生改變，這可能會混淆您的實驗，并導致不確定或錯誤的結(jié)果。此外，關(guān)于永生化細胞如何準確地模擬真實組織還有很多爭論。

盡管存在爭議，但SV40不太可能感染人類，盡管SV40的作用機制：p53和Rb突變可能是人類腫瘤中非常常見的突變。因此，重要的是要確定最佳的基因操作來使用永生你的細胞類型。

盡管永生化細胞在實驗研究中的效用非常強大，但在使用中必須接受一些警告。與任何實驗?zāi)Ｐ鸵粯樱郎毎皇悄A(yù)期細胞系統(tǒng)的模型。

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