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原代小鼠心肌成纖維細(xì)胞分離培養(yǎng)方法

發(fā)布時(shí)間： 2022-10-25　　點(diǎn)擊次數(shù)： 1745次

小鼠心肌成纖維細(xì)胞的組織來源于實(shí)驗(yàn)動物的正常心臟組織，心臟是脊椎動物身體中最重要的一個(gè)器官，主要功能是提供壓力，把血液運(yùn)行至身體各個(gè)部分。

心臟的作用是推動血液流動，向器官、組織提供充足的血流量，以供應(yīng)氧和各種營養(yǎng)物質(zhì)，并帶走代謝的終產(chǎn)物（如二氧化碳、無機(jī)鹽、尿素和尿酸等），使細(xì)胞維持正常的代謝和功能。
心臟中，心肌成纖維細(xì)胞約占正常心肌組織細(xì)胞總數(shù)的60%-70%，是心臟中非心肌細(xì)胞的主要組成部分，廣泛存在于心臟組織中，包圍心肌細(xì)胞，連接心肌細(xì)胞間質(zhì)，與缺血性心臟病、炎癥、肥大、梗死等病理狀態(tài)密切相關(guān)。細(xì)胞生長方式以長梭狀細(xì)胞，貼壁培養(yǎng)。
小鼠心肌成纖維細(xì)胞的方法有很多，賽百慷提供的心肌成纖維細(xì)胞分離方法有兩種，一種是貼塊法，一種是消化法，這兩種方法都可以用于分離和培養(yǎng)原代細(xì)胞。

實(shí)驗(yàn)器械
1.培養(yǎng)皿
2.T-25細(xì)胞培養(yǎng)瓶
3.100目不銹鋼網(wǎng)篩
4.200目不銹鋼網(wǎng)篩
5.眼科剪
6.眼科鑷
7.離心管（15ml、50ml）

實(shí)驗(yàn)分離和培養(yǎng)步驟
1. 小鼠頸椎脫臼處死后，剃除腹胸部的被毛，放入裝有75%酒精的燒杯中浸泡5min。

2. 取出小鼠，在無菌環(huán)境下打開胸腔，取出心臟組織，注入盛有無菌1×PBS的培養(yǎng)皿中，洗凈組織表面的血液。
3. 將清洗干凈的心臟組織轉(zhuǎn)入裝有75%酒精的培養(yǎng)皿中浸泡15s以殺死大多數(shù)的心臟被膜細(xì)胞，浸泡完成后立即轉(zhuǎn)入裝有無菌1×PBS的培養(yǎng)皿中震蕩清洗。
4. 清洗完成后，用剪刀鑷子配合除去主動脈弓和心房組織，僅保留心室部分，再次用1×PBS清洗去除心室內(nèi)的血液。
5. 將清洗干凈的心室組織用剪刀減成1mm3大小左右的碎塊，之后用PBS清洗若干次后按下述兩種方法之一進(jìn)行后續(xù)操作。

A.貼塊法

6. 將清洗好的碎塊轉(zhuǎn)入另一培養(yǎng)皿中，用0.25%胰蛋白酶消化液浸泡組織，室溫消化3-5min。
7. 消化完成后，添加數(shù)毫升FBS終止消化，之后吸棄液體，加PBS清洗組織塊1次后，用200ul吸頭將組織塊平均接種于T-25培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)面上，之后將培養(yǎng)瓶放置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中，靜置2-4h。
8. 待組織處于略微脫水的狀態(tài)時(shí)，小心添加2ml完培養(yǎng)基，添加時(shí)注意盡量不要將組織塊沖起，要使培養(yǎng)基接觸所有的組織塊。
9. 之后放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，一般2-4天后成纖維細(xì)胞會從組織塊周圍爬出，待爬出的細(xì)胞有較多數(shù)量時(shí)，可將細(xì)胞消化下來，去除組織塊，轉(zhuǎn)入另一培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

B.消化法
6. 將清洗好的碎塊轉(zhuǎn)入另一離心管中，加入混合消化液（0.08%胰酶+0.06%Ⅱ型膠原酶）37℃水浴消化8min后，吸取上層混懸液棄去。
7. 余下組織加入混合消化液10ml，37℃水浴震蕩消化10min；吸取上層懸液至另一離心管中，加入適量FBS終止反應(yīng)；剩余沉淀物再加消化液消化3-5次，直至組織塊消化。
8. 按1∶1加入含血清的培養(yǎng)基，中止酶反應(yīng)，懸液過150目網(wǎng)篩去除較大的組織塊。
9. 收集全部中止后的消化液于離心管中，300g，離心10 min，棄去上清，加入培養(yǎng)液重懸細(xì)胞后計(jì)活細(xì)胞數(shù)。
10. 調(diào)整細(xì)胞密度以1× 106個(gè)/ml 接種入的T-25培養(yǎng)瓶中，每瓶添加2ml細(xì)胞懸液。
11. 培養(yǎng)瓶放置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中靜置40min后，吸棄上清液以去除未貼壁的非成纖維細(xì)胞和死細(xì)胞，再添加5ml完培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

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