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羊膜腔接種

發(fā)布時間： 2022-03-25　　點擊次數(shù)： 2841次

羊膜腔接種主要應(yīng)用于從臨床材料中（如患者咽嗽液等）分離流感病毒等操作。這種接種途徑可直接感染羊膜腔的內(nèi)胚層，也可被雞胚咽下或吸入，引起全胚胎感染。另外，病毒也可被排泄到尿囊腔中，使尿囊液中含有大量病毒。因此，在用羊膜腔接種分離病毒時，除可收獲羊水以外，還可收獲尿囊液。

原理

雞胚接種技術(shù)的原理是用病毒（如牛痘病毒（vaccinia virus）和雞新城疫病毒（Newcastle-disease virus））接種雞胚。牛痘病毒適宜于在絨毛尿囊膜上生長，經(jīng)培養(yǎng)后，產(chǎn)生肉眼可見的白色痘皰樣病變，似小結(jié)節(jié)或白色小片云翳狀。雞新城疫病毒適宜接種在尿囊腔和羊膜腔內(nèi)，生長后，雞胚全身皮膚出現(xiàn)出血點，以腦后zui顯著。雞胚培養(yǎng)法是用來培養(yǎng)某些對雞胚敏感的動物病毒的一種培養(yǎng)方法，此方法可用以進行多種病毒的分離、培養(yǎng)，毒力的滴定，中和試驗以及抗原和疫苗的制備等。

材料與儀器

器材：

①孵卵箱

②檢卵燈、照明燈、卵杯、卵盤、雞胚開孔器

③注射器

④眼科用剪刀和攝子、酒精燈和毛細吸管

試劑：

①材料：受精雞卵最好選擇健康來亨雞受精卵，因為來亨雞的卵殼潔白易于照視觀察，如無此卵也可選擇其他受精雞卵。用于病毒培養(yǎng)的受精雞胚，最好是來自無特定病原體雞群。

②消毒劑（2.5％碘酒和 75% 酒精）

③2％來蘇兒液

步驟

羊膜腔接種的基本過程可分為如下幾步：

( 1 ) 接種步驟與方法

1 ) 將 10- 12 日齡的雞胚在檢卵燈上照視，劃出氣室范圍，并在胚胎最靠近卵殼的一側(cè)做記號。

2 ) 用 2.5％碘酒及 75％酒精分別消毒氣室部位的蛋殼，并用開孔器在氣室頂端鉆出一約 10 mmx6 mm 的長方形裂痕，注意勿鉆破殼膜。

3) 用 2.5％碘酒再次消毒鉆孔區(qū)后，用滅菌的眼科小攝子除去長方形卵殼和外層殼膜，并滴加滅菌液狀石蠟一滴于下層殼膜上使其透明，以便觀察胚胎的位置。

4) 將注射器刺向胚胎的騰下胸前，以針頭撥動下顆及腿，當(dāng)進入羊膜腔內(nèi)時，可看到雞胚隨針頭的撥動而動，此時可注入 0.1 -0.2 mL 病毒液。

5 ) 拔出針頭，孔區(qū)先用 2. 5％碘酒消毒，然后用沾有碟酒通過火焰的小塊膠布將卵殼的小窗口封住，并于 33-35 ℃ 孵卵器內(nèi)孵育 48~72 小時，此過程要保待雞胚的氣室朝上。

(2) 解剖與收獲

1) 收獲前雞胚須置 4 ℃ 冰箱 6 小時或過夜，但不能放置時間過長（過長會引起散黃）。如急于收獲亦可置－20 ℃ 冰箱 1 小時左右。預(yù)冷的目的是將雞胚凍死，使血液凝固，避免收獲時流出紅細胞，并同尿囊液中的病毒發(fā)生凝集，造成病毒滴度下降。

2) 用 2.5％碘酒和 75％酒精分別消毒氣室處的卵殼，并用滅菌剪刀剪去氣室部的卵殼，此時勿使其碎片落于未損傷的殼膜上。用無菌毛細吸管吸取尿糞液，然后左手持小攝子夾起羊膜成傘狀，右手用毛細吸管插入羊膜腔吸取羊水，平均每胚可收獲 0.5-1.0 mJ羊水。

3) 病毒通過胚胎機體后被排泄入尿囊腔，因此當(dāng)羊水過少時，可用同胚少量尿攪液沖洗羊膜腔并吸取該洗液。

注意事項

1. 防止污染為了減少污染，整個過程均需無菌操作，否則雞胚一經(jīng)污染，即迅速死亡或影響病毒的培養(yǎng) 。

2. 適宜的培養(yǎng)溫度接種過的雞胚，應(yīng)根據(jù)實驗病原繁殖所需溫度，放入 33~37 °C 溫箱內(nèi)培養(yǎng) 。

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