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補體介導(dǎo)法

發(fā)布時間： 2022-03-11　　點擊次數(shù)： 1625次

原理

帶有特異抗原的靶細胞（如正常細胞、腫瘤細胞、病毒感染細胞）與相應(yīng)抗體結(jié)合后，在補體的參與下，引起靶細胞膜損傷，導(dǎo)致細胞膜的通透性增加、細胞死亡。染料（例如：伊紅-Y、臺盼藍）可通過細胞膜進入細胞內(nèi)使細胞著色，故可用于指示死細胞或瀕死細胞，而活細胞不著色。此即補體依賴性細胞毒試驗，利用細胞毒試驗可以檢查細胞膜抗原，亦可鑒定抗體的特異性。

本實驗中，Thy-1抗原是小鼠胸腺T細胞特異的表面抗原，在體外利用抗小鼠Thy-1的單克隆抗體通過補體的協(xié)同作用，可殺傷95%以上的胸腺細胞。

材料與儀器
C57BL／6J小鼠
Hank’s液單克隆抗體補體伊紅-Y染液
眼科剪眼科鑷平皿不銹鋼網(wǎng) 試管吸量管尖吸管載玻片蓋玻片顯微鏡
步驟

一、實驗方法

1. 小鼠胸腺細胞懸液的制備：將4～6周齡小鼠采用頸椎脫臼法處死，取出胸腺放入已加入約4 ml冷Hank’s液的平皿中，在100目的不銹鋼網(wǎng)上研磨后，過篩，放入試管，離心1 000 rpm，5分鐘，用Hank’s液洗兩次。將沉淀的細胞重懸于Hank’s液中，配成1×107/ml細胞懸液。

2. 取試管3支，標(biāo)明順序，依據(jù)下表依次加入1×107/ml胸腺細胞懸液、抗小鼠Thy-1的單克隆抗體(最適稀釋度)及Hank’s液，放入37℃水浴30分鐘。

3. 取出后每管加入1%伊紅-Y染液1滴，混勻，室溫放置2分鐘。

4. 重新混勻后分別在一張載玻片上滴片，加蓋玻片鏡檢。先在低倍鏡下觀察，再用高倍鏡觀察，比較3管中細胞死活情況。

二、實驗結(jié)果

死細胞呈紅色，無光澤且腫脹變大；活細胞不著色、有光澤且形態(tài)正常。

高倍鏡下計數(shù)200個細胞并計算其中死細胞的百分數(shù)。計算公式如下：死細胞百分數(shù)= EQ EQ \F(實驗管死細胞數(shù)%-對照管死細胞數(shù)%，100%-對照管死細胞數(shù)%)

注意事項

1. 胸腺細胞制備速度要快，且需在冰浴中進行操作，以保持細胞活力；

2. 抗Thy-1的單克隆抗體和補體的效價要在預(yù)實驗中確定；

3. 細胞對照管死細胞數(shù)若超過5%，實驗需重新做；

4. 細胞滴加到載玻片上后長時間放置不檢測也可導(dǎo)致假陽性反應(yīng)。

常見問題

一、實驗材料

1. 解剖器械(眼科剪、眼科鑷)、平皿、80～100目不銹鋼網(wǎng)；

2. 試管、1 ml吸量管、尖吸管；

3. 載玻片、蓋玻片；

4. C57BL/6J小鼠；

5. 含5%NBS的冷Hank’s液；

6. 抗小鼠Thy-1的單克隆抗體（最適稀釋度，本室制備）；

7. 補體(豚鼠新鮮血清并經(jīng)小鼠胸腺細胞吸收，預(yù)先測定效價并稀釋為最佳稀釋度)；

8. 1%伊紅-Y染液。

二、多重PCR的特點

1.高效性

在同一PCR反應(yīng)管內(nèi)同時檢出多種病原微生物，或?qū)τ卸鄠€型別的目的基因進行分型，特別是用一滴血就可檢測多種病原體。

2.系統(tǒng)性

多重PCR很適宜于成組病原體的檢測，如肝炎病毒，腸道致病性細菌，性病，無芽胞厭氧菌，戰(zhàn)傷感染細菌及細菌戰(zhàn)劑的同時偵檢。

3.經(jīng)濟簡便性

多種病原體在同一反應(yīng)管內(nèi)同時檢出，將大大的節(jié)省時間，節(jié)省試劑，節(jié)約經(jīng)費開支，為臨床提供更多更準(zhǔn)確的診斷信息。

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