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SD大鼠骨髓間質干細胞培養方法技巧
發布時間： 2022-01-15 點擊次數： 2375次SD大鼠骨髓間充質干細胞簡單介紹：
骨髓原始間充質干細胞(SD大鼠骨髓間充質干細胞)是骨髓基質干細胞，是人們在哺乳動物的骨髓基質中發現的一種具有分化形成骨、軟骨、脂肪、神經及成肌細胞的多種分化潛能的細胞亞群。它們對骨髓中的造血干細胞（HSC）不僅有機械支持作用，還能分泌多種生長因子（如IL-6，IL-11，LIF，M-CSF及SCF等）來支持造血。
常用的分離MSC的方法主要有全骨髓法和密度梯度離心法，(SD大鼠骨髓間充質干細胞)全骨髓法即根據干細胞在低血清培養基中有貼壁優勢特性，定期換液除去不貼壁細胞，從而達到純化及擴增MSC的目的。密度梯度離心法即根據骨髓中各細胞成分比重的不同，分離單核細胞進行貼壁培養。二者本質上無多大區別。隨著對MSC表面抗原認識的深入，又有人利用免疫方法如流式細胞儀法、免疫磁珠法等對其進行分離純化。但經過流式或磁珠分選后的細胞出現了增殖緩慢等一些問題，加之成本較高和技術的難度，在某種程度上限制了這些方法的廣泛應用。
常見分離方法
目前BMSCs的分離方法主要有:
? 貼壁分離法：根據BMSCs的粘附特性來實現分離貼壁的方法；
? 密度梯度離心法：根據BMSCs與其他細胞的密度不同來分離的方法；
? 流式細胞儀分離法：根據細胞大小或者根據細胞表面的一些特殊標志來分離的方法。
密度梯度離心法與流失細胞儀分離法價格昂貴且操作復雜、容易導致細胞大量流失，應用相對較少。貼壁培養法應用最早，具有操作簡單，對細胞干擾少，不易發生污染等特點較為廣泛應用，其缺點是細胞純度較低，但有關研究表明，BMSCs細胞擴增到P1、P2代后細胞的純度分別可達到95%、98%。
大鼠骨髓間充質干細胞細胞傳代能力測試
大鼠骨髓間充質干細胞生長快速，高密度會影響細胞干性，建議按照1:3比例傳代細胞，傳代建議使用胰酶濃度為0.05%進行消化。消化每t25培養瓶加胰酶1ml。消化時間約1-2min內，t25培養瓶培養液約7ml*培養基。
本次驗證：傳代圖如下（4X）
P1-P5代，按照1:3比例傳代，48H(隔天)傳代一次。每次細胞狀態和增殖能力均良好。
P6-p8代1:3傳代，72h（隔兩天）傳代一次。
P8-P10代1:3傳代，144h（隔6三天）傳代一次。
此時細胞個體變大，生長速度明顯減慢。
細胞形態圖：
細胞處于快速分裂的狀態，良好的MSCs顯示較小的紡錘狀的形態，伴有較多的折光的雙聯體，為新的正在分裂的細胞。細胞首代狀態較好，多數呈長梭形生長，部分不規則，極性良好，經傳代 5次后，細胞仍較有活力。以1:2 的分種率傳代，約48h可長滿。
分化測試
1. 成脂誘導分化
細胞匯合度約達 80%時，加入間質干細胞成脂誘導液后，細胞回縮較明顯。11 天后已有大量脂滴出現，培養21天后進行油紅O 染色，可見被染為紅色的較標準的脂滴。
油紅O染色試劑盒描述：
油紅O是一種脂溶性重氮染料，用于染色細胞和組織中的脂質和脂肪沉積物。雖然樣品可能是新鮮的，冷凍的或福爾馬林固定的，但油紅O與石蠟包埋的組織切片不相容。觀察油紅O沉淀是正常的。因此，必須使用Whatman紙或注射器驅動的過濾器單元通過過濾新鮮制備工作溶液。
2.成骨誘導分化
細胞匯合度約達 70%時，加入間質干細胞成骨誘導液，誘導 21 天可見鈣結質，進行茜素紅染色鑒定， 茜素紅與類骨質結合，形成同心圓狀的深紅色小結節。
茜素紅S染色試劑盒描述：
茜素紅S （Alizarin Red S,簡稱ARS ）作為一種染料型配位劑在分光光度分析方面已有了廣泛的應用。近年來，很多作者把 ARS 及其金屬配位物在汞電極上的吸附催化波用于電分析中，提高了測定的靈敏度和選擇性。
3.成軟骨細胞分化
細胞匯合度約達 70%時，加入間質干細胞成骨誘導液誘導 21 d 后，使用甲苯胺藍染色可見較廣泛的細胞外基質藍紫色，尤其在細胞堆積區，圖中為細胞密度稍低的區域也可見明顯的異染顆粒。
阿利新藍染色試劑盒描述：
阿爾辛藍是一種用于檢測細胞軟骨形成的染料，它可以染色軟骨組織中的硫酸化蛋白多糖。阿爾辛藍染色試劑盒含有1%的阿爾辛藍溶液，0.1%的核固紅，方便，即用型溶液。在pH 2.5時，阿爾辛藍染色酸性粘多糖并顯示藍色，而核固紅染色核粉紅色至紅色，細胞質淡粉紅色。
表面分子流式檢測
CD29:來源 THermoFisher PE
CD90:來源 THermoFisher PE
CD45:來源 THermoFisher FITC
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