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細胞凍存與復蘇的正確操作方法
發布時間： 2021-12-02 點擊次數： 4876次細胞凍存與復蘇，是細胞培養過程中的常見工作。
細胞凍存，是指將細胞貯存在超低溫環境中，使細胞暫時“冬眠"的技術，在需要的時候再進行復蘇。
細胞復蘇，是把凍存在-80℃冰箱或液氮中的細胞快速解凍，并使細胞重新恢復生長的技術。
本文將為大家介紹細胞凍存與復蘇的技術要點和操作步驟。
細胞凍存篇
凍存原則
凍存原則為“慢凍"，即讓細胞在緩慢降溫的條件下逐漸冷凍。
如果直接將細胞懸液放在超低溫下快速冷凍，細胞會受到冷凍損傷而死亡。在凍存液中添加的保護劑（如DMSO、甘油）和在凍存盒中添加的異丙醇，都起到程序性降溫的作用。
DMSO使用注意事項
DMSO能夠快速穿透細胞膜進入細胞中，延緩溫度下降速度，減少細胞內冰晶的形成，從而起到保護細胞的作用。
需注意的是，DMSO溶于培養基時，將釋放大量熱量，所以凍存液需提前配制，不能直接將DMSO加入含有細胞的培養基中，避免燙傷細胞。
另外，DMSO屬于致癌物質，使用時應戴好手套，規范操作。
程序凍存液配方
程序凍存液成分一般由基礎培養基、胎牛血清、DMSO組成。血清比例為10%~90%，DMSO比例為5%~10%。根據普諾賽實驗室經驗，推薦凍存液配比：55%基礎培養基＋40%胎牛血清＋5%DMSO，難養細胞可用90%胎牛血清＋10%DMSO凍存。
細胞凍存密度
細胞凍存和復蘇過程中，不可避免會損失部分細胞，所以凍存的密度不能太低。提高凍存密度有助于提升復蘇存活率，推薦密度為100~300萬細胞/mL。
凍存操作方法
方法一：使用程序凍存盒
使用程序降溫盒是較為常用的凍存方法。市面上的降溫盒有些需要添加異丙醇，有些則不需要。
降溫盒須恢復室溫后再使用。
根據普諾賽實驗室經驗，使用程序凍存盒凍存效果良好，沒有凍存盒的同學可以參照下文方法二和方法三。
操作步驟
步驟1：配制程序凍存液，放在室溫備用或放在4℃預冷
步驟2：離心收集對數生長期的細胞（貼壁細胞消化下來離心，懸浮細胞直接離心，轉速1200rpm或250g，時間3min）
步驟3：用配制好的凍存液重懸細胞，按照1~1.5mL/管分裝到凍存管中，擰緊管蓋，做好標記
步驟4：凍存管放入凍存盒，凍存盒放入-80℃冰箱過夜（24h）
步驟5：凍存管從凍存盒取出，轉移至液氮長期保存
▲ 使用凍存盒操作示意圖
方法二：使用無血清非程序凍存液
無血清非程序凍存液是一種商品化的凍存液，無需自己配制，無需降溫盒，大大提升了便捷性。
但是，并非所有細胞都適用于這種凍存液，使用前必須做凍存測試，沒問題后再批量應用。
操作步驟
步驟1：從冰箱拿出無血清非程序凍存液，待用
步驟2：離心收集對數生長期的細胞（貼壁細胞消化下來離心，懸浮細胞直接離心，轉速1200rpm或250g，時間3min）
步驟3：棄上清，加入適量無血清非程序凍存液，重懸細胞
步驟4：按照1~1.5mL/管的量分裝到凍存管中，擰緊管蓋，做好標記
步驟5：將凍存管直接移入-80℃冰箱中，24h后轉移至液氮長期保存
▲ 使用無血清非程序凍存液操作示意圖
方法三：手動梯度降溫
在沒有凍存盒或者非程序凍存液時，可以選擇手動梯度降溫。但手動梯度降溫不適用于所有細胞，且效果不穩定，同樣需要先做凍存測試。
操作步驟
步驟1：配制程序凍存液，放在室溫備用或放在4℃預冷
步驟2：離心收集對數生長期的細胞（貼壁細胞消化下來離心，懸浮細胞直接離心，轉速1200rpm或250g，時間3min）
步驟3：用配制好的凍存液重懸細胞，按照1~1.5mL/管分裝到凍存管中，擰緊管蓋，做好標記
步驟4：凍存管按照【4℃（20min）→-20℃（30min）→-80℃（24h）→液氮】的順序放置
▲ 手動梯度降溫操作示意圖
細胞復蘇篇
復蘇講究“快融"，越快融化，細胞所受損傷就越小。細胞復蘇的操作不復雜，但每一步都必須穩扎穩打，才能最大限度地提高復蘇存活率。
復蘇步驟
步驟1：水浴鍋預熱至37℃備用
步驟2：準備15mL離心管，并向其中加入適量培養基待用
小貼士：離心管中加入2~9mL的培養基，比較難養的細胞，可適量增加培養基。
步驟3：將細胞凍存管從-80℃冰箱或液氮中取出，放入PE手套中，迅速投入水浴鍋
小貼士：如果冰箱或液氮距離水浴鍋路途較遠（步行超過1min），要把細胞先置于干冰上，再送至水浴鍋。如果將細胞凍存管直接放在手上或口袋里，可能導致溫度逐漸回升而產生冰晶損傷細胞。而將細胞凍存管裝在PE手套中，是為了預防污染。
步驟4：用力搖晃凍存管，使其在1分鐘內融化
小貼士：這一步越快融化越好，最好能放計時器在旁邊。如果1分鐘內沒有融化，可能是凍存液量偏多，或者搖晃力度不夠。
步驟5：用紙巾擦拭水漬，轉移至生物安全柜。用移液槍吸取細胞懸液，緩慢滴加到步驟2中準備好的離心管
小貼士：當同時復蘇多管細胞時，注意不要弄混。
步驟6：1200rpm離心3分鐘
小貼士：離心是為了去除DMSO，對于DMSO敏感的細胞，必須離心；若復蘇的細胞對DMSO不敏感，步驟6、步驟7可以省略，直接將培養基補足至10mL，接種至培養器皿中，第二天換液。
步驟7：棄上清，用新鮮培養基重懸細胞，接種至新的無菌培養器皿中
▲ 細胞復蘇操作示意圖
做完步驟7，細胞就復蘇好了。復蘇的細胞需要一段時間恢復狀態，當復蘇后的細胞密度低于80%時，48小時內不要換液，待細胞形態、生長速度等恢復正常，再進行傳代等操作。（不要因為復蘇后兩三天細胞狀態不好就丟棄，應耐心等待至少一周。）
當然，復蘇后細胞狀態很好的情況下，可以提前開始實驗。
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