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化學感受態細胞進行質粒DNA轉化的原理
發布時間： 2021-10-25 點擊次數： 2531次背景介紹
將質粒DNA轉化入細菌的過程稱為轉化。
轉化通常有兩種方法：化學轉化法和電穿孔法。
電穿孔法的轉化率高達 109 ～ 1010個轉化子/μg 質粒 DNA，轉化率比化學轉化法高，當可能得到的每一個克隆都非常重要時（如構建cDNA文庫），就需要用電穿孔法。
化學轉化法一般每微克 DNA 能獲得105 ～ 106個轉化子，可滿足常規的克隆實驗需求，因此化學轉化法在克隆實驗中是較為常用到的轉化方法。
化學感受態細胞轉化步驟
化學轉化法中用到的感受態細胞是化學感受態細胞，化學感受態細胞常用冰預冷的CaCl2處理細菌的方法來制備。
化學感受態細胞轉化的實驗步驟可以簡單分為以下4步：
1、冰上融化感受態細胞，將DNA加入感受態細胞中，輕彈管壁混勻，冰上放置30 min
2、42 ℃熱激，冰上孵育2 min
3、加入不含抗生素的LB培養基，37 ℃復蘇
4、離心后棄部分上清，重懸后涂板，過夜培養
在化學轉化法的實驗步驟中，為何要冰上放置30 min、熱激、冰上孵育2 min、加入不含抗生素的LB培養基在37 ℃復蘇？每一步的作用及背后的原理是怎樣的？
要理解這些步驟的作用和背后的原理，我們首先要了解下化學轉化法中DNA進入細胞需要克服哪些困難。
DNA要進入細胞需要克服的困難
圖1.DNA和細菌細胞膜的電荷排斥
困難1：DNA帶負電荷，細菌的細胞膜也帶負電荷，需要克服DNA和細胞膜間的電荷排斥作用；
困難2：DNA進入細胞需要細胞膜上有孔隙。
01
克服電荷排斥
化學感受態細胞轉化的第一步，加入DNA后，輕彈管壁混勻，冰上靜置，使Ca2+與DNA結合中和DNA的負電荷，Ca2+與細菌細胞膜結合中和電荷，克服了外來DNA和細菌細胞膜之間的負電荷排斥作用。Ca2+與DNA和細菌細胞膜脂多糖的磷酸鹽形成配位絡合物，Ca2+促進了DNA和脂多糖的結合。
圖2.Ca2+克服了外來DNA和細菌細胞膜之間的負電荷排斥
02 孔隙的形成與消失
化學感受態細胞轉化的第二步是熱激。熱激使溫度升高，細胞膜的脂質釋放（圖3-A），在細胞膜上形成孔隙（圖4-E），DNA進入細菌內部。熱激后在冰上冷卻2 min，溫度降低，細胞膜的蛋白質釋放（圖3-B），脂質占比增高，細胞膜的流動性升高，細胞膜上的孔隙消失（圖4-F）。
圖3. A：脂質釋放曲線，B：蛋白質釋放曲線
圖4.感受態細胞在轉化過程中表面形態的變化
03 抗性基因的表達
化學感受態細胞轉化的第三步，加入LB培養基，37 ℃復蘇，該步驟的主要作用是使感受態細胞恢復生長，使感受態細胞中的質粒表達抗性基因，這樣在涂板后帶有目標質粒的大腸桿菌在相應抗性的平板上才能正常生長。
綜上，化學感受態細胞在轉化過程中進行冰上放置是為了使DNA吸附到感受態細胞表面；熱激步驟使感受態細胞表面形成孔洞，DNA進入感受態細胞內；冰上孵育使感受態細胞的孔洞消失；37 ℃復蘇是為了是細胞恢復生長并表達抗性基因。 本期的克隆小講堂之化學感受態細胞轉化原理的介紹就到這里，下面為您推薦一波優質的化學感受態細胞產品，為您的研究添磚加瓦。 
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