細胞轉染實驗技術——功能實驗的第一步

發布時間： 2021-10-21　　點擊次數： 2909次

轉染(transfection)是真核細胞主動或被動導入外源核酸片段（DNA或RNA）而獲得新的表型的過程。轉染后的細胞會產生重組蛋白，或者特異性的增強/抑制細胞中的基因表達。轉染后的檢測主要包括基因水平和蛋白水平的檢測。一定時間后收集轉染處理后的細胞，采用超聲或酶解的方法破碎細胞，離心得到上清。針對基因水平，使用普通 PCR 或 RT-PCR 進行驗證，蛋白水平，使用 western blot 檢測，簡單，快速，準確。

細胞轉染實驗技術——功能實驗的第一步

轉染的類型

根據導入的核酸存在于宿主細胞的時間長短，可以分為瞬轉和穩轉。根據轉染方式可以分為化學方法，生物方法，物理方法。

瞬時轉染是指將構建好的質粒或者siRNA通過某種方式導入到哺乳動物細胞內（常用的工具細胞 HEK293 細胞），該外源核酸片段不整合到細胞自身的基因組上。隨著細胞的生長分裂，外源基因會逐漸丟失，在細胞內能夠存在 3-4 天，無法隨著細胞的分裂進入到子代細胞中。在這一段時間內，外源基因在細胞內發生轉錄翻譯，得到少量的蛋白。根據使用的載體不同，收集目的基因/蛋白進行檢測的時間不同，通常在轉染后48h，目的蛋白的表達水平最高。瞬時轉染的特點是短時間內進行蛋白的小量制備，滿足后續的實驗要求。

穩定轉染是外源DNA整合到細胞基因組中，成為細胞基因組的一部分從而得以復制，隨著細胞分裂，子代細胞也同樣表達外源基因，這就是穩定轉染細胞的標志。穩定轉染是建立在瞬時轉染的基礎上的，先對細胞進行轉染，再對得到的細胞池進行篩選，篩選標記是抗生素，熒光報告基團等，通常需要2-3周的篩選時間，由此形成穩定轉染的細胞系。穩定轉染的特點是能夠得到蛋白的大量、長期生產，滿足后續的一系列體內體外的表型實驗。

轉染方式

考慮到轉染效率是影響細胞實驗的重要因素，因此選擇合適的轉染試劑和轉染方式很關鍵。下面我們介紹一下常見的轉染方式。

細胞轉染實驗技術——功能實驗的第一步

細胞由帶負電荷的磷脂雙分子層構成，對于也帶負電荷的核酸片段（DNA和RNA）來說是不可透過的屏障，因此研究人員開發了很多方法能使核酸穿透細胞膜進入胞內，大致分為三類：

轉染方法	原理	優點	缺點
化學轉染方法
陽離子脂質體	脂質體是一種人工的脂雙層膜。陽離子脂質體通常由陽離子和兩性離子脂質組成。在DNA與脂質體形成lipoplex的過程中，陽離子脂質體起到復合和凝集DNA的作用，同時也有助于復合物與細胞膜的結合	操作簡單快速；轉染效率高且重復性好；可用于轉染DNA、RNA和蛋白；可用于瞬時轉染和穩定轉染	會受到血清的抑制，降低轉染效率；脂質體中的核心組分對細胞毒性較大
磷酸鈣共沉淀	核酸以磷酸鈣-DNA 共沉淀物的形式出現時，可使DNA 附在細胞表面，利于細胞吞入攝取，或通過細胞膜脂相收縮時裂開的空隙進入細胞內	便宜，使用廣泛	轉染效率差，不穩定；細胞毒性大；
葡聚糖	它是一種陽離子聚合物，可以與帶負電荷的DNA和蛋白質結合，進而被細胞吞噬	多用于貼壁細胞	一些細胞類型對葡聚糖特別敏感，可能會發生形態變化或者抑制細胞生長
其他陽離子聚合物	帶正電的聚合物與核酸帶負電的磷酸基團形成帶正電的復合物后與細胞表面帶負電的蛋白多糖相互作用，并通過內吞作用進入細胞。陽離子聚合物和陽離子脂質體最大的區別在于陽離子聚合物不含疏水部分而溶于水，可以方便地進行化學修飾，且不會像脂質體一樣破壞細胞結構，所以相對毒性較低。目前使用泛的陽離子聚合物轉染試劑是PEI（聚乙烯亞胺）	成本低；免疫原性低；轉染效率高且穩定；適用于懸浮細胞或貼壁細胞	細胞毒性較大；常用于瞬時轉染；不能生物降解
物理轉染方法
電穿孔	利用高脈沖電壓破壞細胞膜電位，使得DNA 通過膜上形成的小孔導入穩定/瞬時性轉染	適用所有細胞類型；適用瞬時轉染和穩定轉染；不需要載體	需要一定的電轉設備；需要優化電轉脈沖和電壓參數；細胞致死率高； DNA和細胞用量大
顯微注射	利用管尖極細（0.1至0.5μm）的玻璃微量注射針，將外源基因片段直接注射到原核期胚或培養的細胞中	適用所有細胞類型；可進行單細胞轉染；不需要載體；不限制轉入的基因大小和數量；多用于轉基因	設備昂貴；技術要求高；細胞致死率高
生物轉染方法
病毒轉染	病毒該載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達到持久性表達	轉染效率高；適用于難轉染的細胞系；可用于體內轉染	周期長，程序復雜；費用相對高；存在生物安全問題

轉染的影響因素：

轉染過程中許多因素會影響轉染效率：如細胞類型；細胞密度；質粒大小、質粒純度；血清；轉染試劑等。轉染實驗中，以下幾個因素進行調整和優化：

1. 轉染前的細胞狀態和密度

轉染時細胞密度以 50-80%最佳，細胞密度過高會嚴重影響細胞狀態和轉染效率（周期進程阻滯，凋亡增加等）。同時支原體污染會嚴重降低細胞的轉染效率，因此轉染前可用環丙沙星處理細胞以除去支原體。

2. 轉染時的質粒純度

如果提取的質粒不純，如帶少量鹽離子，蛋白、代謝物污染等都會顯著影響轉染復合物的有效形成；而含有內毒素的質粒對細胞存在很大的毒性作用（一般用去內毒素的提取試劑盒）。抗生素一般對真核細胞無毒，但轉染過程中細胞通透性增加，會使抗生素進入細胞，從而降低細胞活性，導致轉染效率降低。

3. 轉染后的篩選時間

轉染后篩選不能太早或太晚，因為轉染了外源基因的細胞代謝負荷大，增殖較慢，太晚會被沒有外源基因轉入的細胞所淹沒，最終導致篩選不出陽性克隆。一般要在轉染后48h之后開始加抗生素篩選。

4. DNA 與轉染試劑的比例

許多轉染方法需要優化 DNA 與轉染試劑的比例。不同細胞系轉染效率通常不同，不同轉染試劑轉染效率差別很大，通常需要根據轉染試劑說明書進行預實驗，選擇合適濃度的外源DNA或RNA，調整外源核酸片段和轉染試劑的比例。

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